——新型基于單分子級別熒光共振能量轉(zhuǎn)移(smFRET)的動態(tài)結(jié)構(gòu)生物學(xué)共聚焦顯微鏡系統(tǒng)

量化單分子和時間分辨熒光技術(shù)，為很多生命科學(xué)與材料科學(xué)領(lǐng)域提供了新的視野。迄今為止，因為其數(shù)據(jù)采集和分析需要具備較為專業(yè)的背景知識，使得該技術(shù)的普及非常緩慢。現(xiàn)在，PicoQuant可以提供一款全新的共聚焦顯微系統(tǒng)——單光子計數(shù)共聚焦顯微鏡系統(tǒng)Luminosa，它具備先進(jìn)的軟硬件組合，在簡化日常操作流程的前提下，能有效的為操作者呈現(xiàn)高質(zhì)量的實驗數(shù)據(jù)。其配備的軟件為每種應(yīng)用技術(shù)都設(shè)定了標(biāo)準(zhǔn)化的引導(dǎo)操作流程。

本文將為您介紹單光子計數(shù)共聚焦顯微鏡Luminosa系統(tǒng)如何簡化單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移(smFRET)的實驗過程。

單光子計數(shù)和計時應(yīng)用開啟了一個全新的實驗維度

共聚焦熒光顯微鏡在過去四十年中越來越受歡迎，因為其可視化動態(tài)過程和細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使其成為一種用于分子、細(xì)胞和發(fā)育生物學(xué)的常規(guī)主力儀器。除了成像之外，點測量相關(guān)的實驗方法，例如熒光相關(guān)光譜(FCS)和單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移(smFRET)也在生物物理學(xué)領(lǐng)域日漸普及。最近發(fā)展起來引入時間分辨的實驗方法更是頗為引人注目。

對熒光基團(tuán)熒光壽命的測量，揭示了新的信息維度，可以和光譜信息相互補充。每個熒光基團(tuán)的熒光壽命信息是只有的，因此可以作為多重檢測的識別特征。它同時也可以被單分子間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移所影響，例如，由于受體的存在導(dǎo)致供體壽命下降而反應(yīng)出的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率。

迄今為止，使用時間分辨熒光技術(shù)的門檻相對較高，需要專業(yè)的背景知識。而全新的單光子計數(shù)共聚焦顯微鏡系統(tǒng)Luminosa大大降低了使用門檻，并且將多種時間分辨工具集成統(tǒng)一。并為以下研究領(lǐng)域提供新的視野:
?單分子級別的動態(tài)結(jié)構(gòu)生物學(xué)
?相位分離引起的細(xì)胞機制
?環(huán)境監(jiān)測
?細(xì)胞膜的動態(tài)和結(jié)構(gòu)成像
?功能性的納米囊泡特性檢測
?研究單分子級別下的化學(xué)反應(yīng)
?先進(jìn)材料的特性表征
?質(zhì)量和穩(wěn)定性檢測

在這些研究領(lǐng)域中，實驗復(fù)現(xiàn)是一個難題。可能的原因之一在于所使用的顯微方法的細(xì)節(jié)描述不充分。為了提升準(zhǔn)確性，可重復(fù)性以及實驗質(zhì)量，通過顯微系統(tǒng)的自動化來減少人為誤差是一個潛在的可行方案，例如，硬件部件的自動化，以及將傳感單元集成到智能軟件中。這也增加了成像系統(tǒng)的易用性，總而言之，為研究人員節(jié)省了寶貴的時間和材料。此外，自動化提高了通量，甚至開辟了新的實驗可能性，如延時成像、多位置成像或多點時間軌跡。

直觀的工作流程，易于使用

單光子計數(shù)共聚焦顯微鏡系統(tǒng)Luminosa在壽命測量領(lǐng)域有著最佳的性能表現(xiàn)。該顯微系統(tǒng)同樣對于單分子靈敏度進(jìn)行了優(yōu)化，可以進(jìn)行單分子級別的各種實驗。我們通過MicroTime200系統(tǒng)的實驗經(jīng)驗設(shè)計了這個全新的顯微鏡系統(tǒng)，并為它挑選了一批最佳硬件組合。通過精簡和優(yōu)選后的光學(xué)元件使得該系統(tǒng)達(dá)到了很高的靈敏度水平。

用戶既可以選擇使用高速的振鏡系統(tǒng)進(jìn)行掃描成像，也可以一鍵切換為壓電平移臺的物鏡掃描模式。這種切換功能目前在其他顯微系統(tǒng)中是沒有的。壓電掃描成像避免了振鏡掃描模式下的信號損失，根據(jù)波長的不同，大約可以提升20-30%左右的光子信號。用戶同時也可以選擇時間響應(yīng)更優(yōu)秀的混合式光電倍增管探測器，或者高探測靈敏度的單光子雪崩二極管作為定制配置。

超簡單的界面操作流程

單光子計數(shù)共聚焦顯微鏡系統(tǒng)Luminosa軟件是從頭開始創(chuàng)建的。它的設(shè)計使其工作流程簡單快捷，使用戶能夠更加專注于樣品特性本身。良好的交互界面布局，清晰排列的界面僅顯示與每個應(yīng)用相關(guān)的參數(shù)，保證了測量數(shù)據(jù)的重復(fù)精度。單光子計數(shù)共聚焦顯微鏡系統(tǒng)Luminosa軟件包括smFRET功能，F(xiàn)CS熒光相關(guān)光譜，以及時間分辨成像功能，同時也具備有自定義測量和分析模式。

系統(tǒng)只需單擊一個按鈕，在不到一分鐘的時間內(nèi)，便可完成無樣品自動對準(zhǔn)。對準(zhǔn)非常準(zhǔn)確，無需進(jìn)一步優(yōu)化即可直接進(jìn)行FCS熒光相關(guān)光譜測量，所以通過簡單的操作就可以確保系統(tǒng)始終處于相同的最佳狀態(tài)。

開始操作時，用戶選擇在下一個實驗中使用哪種測量技術(shù)方法。軟件中清晰排列的軟件界面僅顯示該類型測量所需的參數(shù)，從而將意外錯誤的風(fēng)險降至最小。根據(jù)選擇樣品中存在的熒光團(tuán)，硬件會自動正確配置。然后根據(jù)實驗環(huán)境分配分析通道。大多數(shù)商用LSM共聚焦顯微系統(tǒng)中已經(jīng)提供了類似的功能，但是現(xiàn)在還設(shè)置了對時間分辨測量很重要的其他參數(shù)（例如激光的重復(fù)頻率），從而減少對用戶所需專業(yè)知識的要求。設(shè)置的保存和加載，保證了測量的可重復(fù)性。此外，適當(dāng)?shù)脑紨?shù)據(jù)與實際數(shù)據(jù)一起保存，方便以后查詢使用。

圖2. 使用532nm和640 nm脈沖交錯激發(fā)和雙通道檢測的smFRET實驗的硬件和分析設(shè)置屏幕截圖，產(chǎn)生三個邏輯分析通道。

激發(fā)光的功率校準(zhǔn)模塊同時可以提供設(shè)置和顯示激發(fā)功率(單位μw，如圖2)的功能，并且不需要額外的功率測量設(shè)備。自動調(diào)節(jié)耗時不到十秒，而且可以在不移動樣品的情況下連續(xù)進(jìn)行。參考文獻(xiàn)[2]表明了激發(fā)光強的精確控制在可重復(fù)精度中的重要性，例如它會影響到光漂白，光毒性等等，從而在結(jié)果中引入不確定性。 這個問題對實驗的影響非常大， QUAREP - LiMi (光顯微鏡質(zhì)量和重復(fù)精度評估組織)也將激發(fā)光功率的控制放在工作的首要位置。

在實驗進(jìn)行測量時，會實時顯示多個在線預(yù)覽。這樣用戶就可以把控樣品的情況，從而進(jìn)一步進(jìn)行正確的采集參數(shù)設(shè)定。在線實時分析實際上是一種動態(tài)幫助信息，旨在提高采集到的數(shù)據(jù)質(zhì)量。

新軟件結(jié)合了用于熒光壽命成像(FLIM)，熒光相關(guān)光譜(FCS)和單分子檢測的GPU加速算法。 強大的算力使得其可以實現(xiàn)自動分析程序，并將有關(guān)實驗類型、硬件配置、熒光團(tuán)和數(shù)據(jù)維度的信息考慮在內(nèi)，因此無需用戶交互即可獲得初始結(jié)果。盡管如此，原始數(shù)據(jù)保持不變，以便于以后可以使用不同的參數(shù)設(shè)置重新分析。

基于動態(tài)結(jié)構(gòu)生物學(xué)的單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移(smFRET)

圖3. 典型的smFRET應(yīng)用 - 研究蛋白和DNA的作用

單分子研究，以及更具體的smFRET方法學(xué)，已成為研究蛋白質(zhì)和核酸動態(tài)結(jié)構(gòu)變化的標(biāo)準(zhǔn)工具。這些實驗方法可以揭示在納秒到秒級別的時間維度上的動態(tài)活動過程。例如成鏈動力學(xué)，蛋白的結(jié)合，折疊，探測變構(gòu)信號，寡聚化以及聚集現(xiàn)象，如圖3所示。實驗結(jié)果對其他實驗方法，例如電鏡，核磁共振等，進(jìn)行了有效的補充。這樣完整的數(shù)據(jù)就可以被歸檔到到綜合結(jié)構(gòu)模型的存檔系統(tǒng)PDB-Dev [3]。近年來，內(nèi)在無序蛋白質(zhì)的生物學(xué)相關(guān)性研究越來越多，突出了這些方法的力量。

smFRET測試既可以在分子自由移動的溶液中進(jìn)行，也可以對分子固定在蓋玻片表面上的樣品實施探測。單光子計數(shù)共聚焦顯微鏡系統(tǒng)Luminosa為兩種樣品分別提供了專門的工作流程。

選擇正確的FRET對信息后，硬件會自動切換到對應(yīng)的配置，即設(shè)置激發(fā)波長和功率，啟用供體和受體的脈沖交錯激發(fā)，并選擇正確的檢測器和發(fā)射濾光片，如圖2所示。此外，系統(tǒng)會根據(jù)實驗條件選擇分析通道：供體激發(fā)后的供體發(fā)射，供體激發(fā)后的敏化受體發(fā)射和直接受體激發(fā)后的受體發(fā)射作為對照。可以選擇不同的停止條件進(jìn)行采集。例如，在分子溶液樣品測試時，停止條件可以是爆發(fā)發(fā)射數(shù)量、總時間、爆發(fā)頻率的減少量等等。這有助于收集具有充分統(tǒng)計數(shù)據(jù)的一致數(shù)據(jù)集。

采集數(shù)據(jù)時會顯示四種在線數(shù)據(jù)預(yù)覽: FRET效率（E）與化學(xué)計量（S）的直方圖、爆發(fā)直方圖、強度時間軌跡和TCSPC直方圖，以及用于供體和受體壽命衰減的在線擬合。E和S在線計算并顯示在E/S直方圖中。根據(jù)[4]中的數(shù)據(jù)處理標(biāo)準(zhǔn)步驟，這些在線數(shù)據(jù)通過四種因子進(jìn)行校正。這些校正因子分別是：光譜串?dāng)_因子α，激發(fā)波動因子β，探測效率因子γ以及直接激發(fā)因子δ。校正后以及未校正數(shù)據(jù)都在圖4中有所顯示，這樣就可以評估校正步驟帶來的影響，這些因子在隨后都可以手動進(jìn)行修改。

圖4. E/S直方圖將單個FRET爆發(fā)的值顯示為單個點，綠色為校正后的曲線，紅色為未校正曲線。

分子穿過固定的激光聚焦光斑時，所發(fā)出的熒光信號被采集。這些信號可以連同共聚焦針孔大小來確定聚焦光斑的體積。觀察時間窗口，例如，爆發(fā)持續(xù)時間是由聚焦體積來決定的。在衍射極限級別的聚焦體積下，極短時間內(nèi)就有高量級的光子產(chǎn)出，可以被用于監(jiān)控快速的分子動態(tài)過程。增大聚焦體積的同時會延長爆發(fā)持續(xù)時間，如圖5所示。這樣就可以觀察慢速分子的動態(tài)過程和測量大分子較緩慢的擴(kuò)散特性。總體上說，如[5]中表述的，“更大的聚焦體積，結(jié)合高功率的激發(fā)，每個爆發(fā)持續(xù)時間能產(chǎn)出最高的光子量級"。單光子計數(shù)共聚焦顯微鏡系統(tǒng)Luminosa能夠根據(jù)激發(fā)波長的不同，將觀察體積從衍射極限的3倍增加到6倍。在軟件中點擊一個按鈕，可以減小激發(fā)光束直徑，對物鏡進(jìn)行下充，相應(yīng)調(diào)整光路和共焦探測針孔的大小，從而增加有效觀測體積。

圖5. 爆發(fā)持續(xù)時間對比圖，紅色為較大聚焦體積下，藍(lán)色為較小聚焦體積下。

在研究分子固定在表面的樣品時，用戶既可以選擇壓電掃描臺來獲得更多的光信號，也可以選擇振鏡掃描方式來快速成像。樣品自動保持對焦，而平鋪和拼接可實現(xiàn)大面積成像，如圖6所示。

圖6. 用Cy3B和Atto647N標(biāo)記的單DNA折紙固定在表面上。九張成像圖片拼接成了一張21x21µm的圖像。右圖：單張小圖的FLIM分析結(jié)果。上圖：平均壽命圖。下圖：多指數(shù)壽命擬合結(jié)果疊加圖。樣品數(shù)據(jù)由弗里堡大學(xué)，物理學(xué)院提供。

采集到一個成像圖塊后，通過自動算法在特定標(biāo)準(zhǔn)下，測算出單分子的位置。隨后對這些單分子進(jìn)行逐個探測，并在停止條件達(dá)到之前記錄其光強隨時間變化的數(shù)據(jù)。然后，下一個圖塊區(qū)域?qū)⒈粧呙韬统上瘢源祟愅啤Ｍㄟ^這種方式，可以輕松獲得具有足夠統(tǒng)計數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)集。

討論和展望

單光子計數(shù)共聚焦顯微鏡系統(tǒng)Luminosa的自動化工作流程提高了系統(tǒng)的易用性并減少了人為錯誤，從而節(jié)省了研究人員的寶貴時間和樣品材料。重要的是，自動設(shè)置的參數(shù)值可以保存為元數(shù)據(jù)，而在手動系統(tǒng)中，必須手動記錄這些值。綜上所述，與手動操作的系統(tǒng)相比，該系統(tǒng)提高了實驗的精確度、可重復(fù)性和實驗質(zhì)量。但是，審查配置和設(shè)置（例如染料數(shù)據(jù)庫條目或丟棄事件的閾值）以確保它們適合新實驗仍然是很重要的。

許多專業(yè)的知識應(yīng)用于制定系統(tǒng)的工作流程和參數(shù)設(shè)定中，所以實際使用人員并不需要具備相關(guān)專業(yè)知識。即便如此，在樣品制備和數(shù)據(jù)闡釋方面，用戶仍然需要一定的知識儲備。

PicoQuant持續(xù)研發(fā)新的熒光顯微鏡科研工具，例如光譜分辨FLIM系統(tǒng)，結(jié)合了壽命和光譜信息，可同時并行多目標(biāo)成像，詳情參閱文章[6]和[7]。PicoQuant同時活躍于各種與學(xué)術(shù)界合作的研究項目中，來拓展新型顯微系統(tǒng)的概念和實驗方法。例如，NG-FLIM計劃，旨在實現(xiàn)一種高空間分辨率和高時間分辨率的顯微系統(tǒng)，這樣可以更加簡便和精確的在活體細(xì)胞和組織中快速觀察膜受體的情況。不同的光學(xué)方法再結(jié)合起來以提高成像的對比度，基于深度學(xué)習(xí)的數(shù)據(jù)處理方式用于自動化的數(shù)據(jù)評估。這項計劃的參與者包括PicoQuant、Nanotag Biotechnologies、Arivis、哥廷根大學(xué)以及哥廷根中心醫(yī)藥大學(xué)。該計劃由德國聯(lián)邦教育和研究部的"Photonics Research in Germany"項目(項目編號 13N15324)撥款。另一個例子就是糾纏態(tài)的雙光子吸收，可以被應(yīng)用于化學(xué)選擇性熒光顯微鏡。PicoQuant正與弗勞恩霍夫應(yīng)用光學(xué)和精密工程研究所、M Squared Lasers以及耶拿大學(xué)一起合作研究此主題。該方向同樣由德國聯(lián)邦教育和研究部支持，隸屬于LIVE2QMIC(13N15953)研究項目。

結(jié)論

PicoQuant的新型單光子計數(shù)共聚焦顯微鏡系統(tǒng)Luminosa可以幫助研究者輕松的將單分子時間分辨熒光顯微實驗方法廣泛應(yīng)用于生命和材料科學(xué)研究領(lǐng)域，而不需要操作者本身具備豐富的經(jīng)驗。得益于新的軟件功能與先進(jìn)的硬件相結(jié)合，并且更好地集成了硬件和軟件，該系統(tǒng)以可重復(fù)的方式快速提供高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。這使研究人員能夠自信地采用smFRET等新方法，從新的角度觀察樣品。

[1] M.Baker: 1,500 scientists lift the lid on re-producibility，Nature 533 (2016) 452–454。
[2] P.Montero Llopis et al.: Best practices and tools for reporting reproducible fluores-cence microscopy methods，Nat Methods 18 (2021)1463–1476。
[3] E.Lerner，A. Barth，J.Hendrix et al.: FRET-based dynamic structural biology: Challenges， perspectives and an appeal for open-science practices.Ashok.(2021) eLife 10:e60416。
[4] B.Hellenkamp，S.Schmid，O.Doros-henko et al.: Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements – a multi-laboratory benchmark study，Nat Methods 15 (2018) 669–676。
[5] G.Agam，C.Gebhardt，M.Popara et al.: Re-liability and accuracy of single-molecule FRET studies for characterization of struc-tural dynamics and distances in proteins.(2022)bioRxiv 2022.08.03.502619。
[6] T.Nieh?rster et al.: Multi-target spectrally resolved fluorescence lifetime imaging mi-croscopy，Nat Methods 13 (2016) 257–262。
[7] S.Rohilla et al.: Multi-target immuno-fluorescence by separation of antibody cross-labelling via spectral-FLIM-FRET，Sci Rep 10 (2020) 3820。

德國PicoQuant

PicoQuant由四位年輕的科學(xué)家和工程師于1996年成立，致力于發(fā)展真正為科學(xué)家所使用的光學(xué)儀器。該公司注重于在眾多科學(xué)領(lǐng)域為各國科研工作者提供創(chuàng)新型和高質(zhì)量的產(chǎn)品。 PicoQuant不忘初衷，砥礪前行，現(xiàn)已成為時間分辨光學(xué)測量領(lǐng)域的行業(yè)者。

關(guān)于作者

Maria Loidolt-Krüger曾就讀于凱澤斯勞滕大學(xué)生物物理系，并在哥廷根普朗克研究所的Stefan Hell小組獲得碩士和博士學(xué)位，專業(yè)方向圍繞STED顯微系統(tǒng)的進(jìn)一步開發(fā)。2018年畢業(yè)后即加入PicoQuant公司，成為顯微應(yīng)用專家。2022年作為PicoQuant公司科學(xué)內(nèi)容創(chuàng)作者。同時也在柏林應(yīng)用科技大學(xué)兼職講師，主要方向為光顯微學(xué)。